今天小编向大家介绍一位青年学者，来自美国加州大学圣巴巴拉分校的杨扬（Yang Yang）教授。
杨扬，2011年在北京大学获得化学学士学位，师从王建波教授进行本科研究。随后，他在麻省理工学院获得有机化学博士学位，师从Stephen Buchwald教授。在麻省理工学院，他的研究重点是铜催化的简单烯烃的不对称水官能团化。作为美国国立卫生研究院博士后研究员，杨博士与加州理工学院的Frances Arnold教授合作，开发了一种用于C(sp³)–H键不对称胺化的通用酶促平台。 2020 年夏天，杨扬教授在加州大学圣塔芭芭拉分校化学与生物化学系开始了他的独立研究生涯。他的实验室的科研集中于生物催化的不对称反应以及天然产物的化学酶法合成。杨扬教授曾获得摄政青年教师奖学金（2021年）、教师职业发展奖（2022年）、NSF职业奖（2022年）、美国国立卫生研究院最大化研究者研究奖（2022年）、蒂姆化学期刊奖（2023年）、陆军研究办公室青年研究员奖（2023年）、帕卡德奖学金（2023年）和斯隆研究奖学金（2024年）。 据不完全统计，杨扬教授已发表4篇《Science》！5篇Nature大子刊！
近日，《Nature Chemistry》以题为“Stereodivergent photobiocatalytic radical cyclization through the repurposing and directed evolution of fatty acid photodecarboxylases”报道了杨扬教授课题组的最新研究成果。
尽管天然存在的光酶具有令人着迷的光物理和光化学活性，但尚未被重新用于新的自然活性。 鉴于此，加州大学圣塔芭芭拉分校杨扬教授与匹兹堡大学刘鹏教授设计了脂肪酸光脱羧酶，通过利用强氧化性激发态黄酮醌辅助因子来催化非天然光氧化还原自由基C-C键的形成。通过基因组挖掘、合理工程和定向进化，他们开发了一组自由基光环化酶，以促进脱羧自由基环化，具有优异的化学选择性、对映选择性和非对映选择性。高通量实验工作流程允许脂肪酸光脱羧酶的定向进化。一组正交的自由基光环化酶被设计用于获得立体化学二元体的所有四种可能的立体异构体，在不对称自由基生物催化中提供完全的非对映和对映异构生物转化。分子动力学模拟表明，进化的自由基光环化酶可以轻松获得近攻击构象，从而实现化学选择性自由基环化。立体选择性自由基光环化酶的发展在天然光酶家族中提供了非自然的C-C键形成活性，可用于控制自由基介导反应的立体化学。
【设计】
如果天然FAP能够被设计成允许用C=C双键拦截新生的以碳为中心的自由基，作者将能够开发新的天然自由基光环化酶(RAP)来促进立体控制的自由基环化反应（图1）。在本文设想的催化循环开始时（图1a），可见光照射产生光激发的强氧化性黄酮醌FADq*。单电子从羧酸盐底物转移到FADq*，然后快速脱羧，将生成烷基自由基和黄酮半醌FAD•−(FADsq)。在此阶段，该亲核烷基自由基物质将与悬垂的α,β-不饱和羰基加成，以提供新的以碳为中心的自由基。随后涉及黄酮半醌FAD•−和保守氨基酸残基的电子转移/质子转移(ET/PT)或质子耦合电子转移(PCET)将以立体控制的方式提供产物并再生FAD辅因子，从而完成催化循环。
图 1. FAP 的重新利用和定向进化为全新的立体选择性 RAP
【RAP 活性的发现】
根据鲍德温规则，最初的工作重点是α,β-不饱和酯-羧酸底物1a的对映选择性脱羧自由基环化（图2）。作者选择的FAP同源物子集的系统发育树如图2a所示。在与脂肪酸底物复合的野生型CvFAP的晶体结构中（图2b），构象灵活的脂肪酸底物被迫在CvFAP的疏水通道中采用稍微扭结但很大程度上延伸的结合模式。在这种结合构象中，羧酸根前体和α,β-不饱和自由基受体彼此远离，不利于本文提出的自由基环化。在检查野生型 CvFAP 的晶体结构后，发现 466 (Y466) 处的酪氨酸残基在形成底物隧道中具有关键作用（图 2b）。用丙氨酸取代该酪氨酸将显著拓宽 CvFAP 的活性位点，从而促进自由基环化。结果发现，CvFAP 能够促进自由基环化，且具有较低的初始活性和适度的对映选择性。其他几种 FAP 也催化了这种激进的环化反应。有了这些初步结果，作者试图进行定向进化，以提高源自 FAP 的 RAP 的活性、化学选择性和对映选择性（图 2c）。凭借这些进展，作者进行了多轮位点饱和诱变和筛选，以进化出新的 RAP。
图 2. 化学选择性和立体选择性 RAP 的开发：FAP 的开采和工程
【底物拓展】
有了一组进化的RAP，作者接下来调查了这种光酶自由基环化的底物范围（图3）。除了乙酯2a之外，甲酯(2b)、正丙酯(2c)和2-溴乙酯(2d)也是光生物催化自由基环化的优异底物，导致环化产物具有良好至优异的对映选择性。内酯2e也可以以良好的收率和对映体控制进行转化。重要的是，α-卤素取代的α,β-不饱和酯也是优异的自由基受体，产生高度对映体富集形式的α-氟酯(2f)、α-氯酯(2g)和α-溴酯(2h)。因此，这些进化的RAP提供了一种以催化不对称方式制备对映体富集α-卤代酯的新方法。
图 3. RAP催化的不对称脱羧自由基环化的底物范围
【非对映异构和对映异构 RAP】
作者进一步挑战工程RAP，以立体发散的方式在α和β位置设置两个连续的立体中心（图4）。具体来说，从CvRAP₄开始，通过迭代定点诱变和筛选，CvRAP₄(A466F/S465M/V463A)(CvRAP₅)得到了具有倒置α立体化学结构的(2R,3S)-2p，产率为55%，d.r.为59:41，e.r.为90:10（图4）。此外，第四种立体异构体(2R,3R)-2p也可以用另一种进化的RAPCvFAPAAAA(I130F/T484S/V463N)(CvRAP₆)合成，产率为89%，d.r.为78:22，e.r.为96:4（图4）。
图 4. 正交光酶变体 CvRAP₃–CvRAP₆ 的定向进化，用于 1p 与 CvRAP₂–CvRAP₆ 的立体发散不对称自由基环化
【立体会聚光生物催化自由基环化】
本文报道的所有四种可能的立体异构体的生物催化剂控制的、完全非对映和对映异构体的获得代表了所有酶类别的不对称自由基生物催化领域的一个例子，突出了天然FAP光酶的特殊可调性。此外，CvRAP₆可以将1a转化为2a，收率为86%，有效转化率为25:75。具有反向对映选择性（图5a）。CvRAP₁和CvRAP₆共同构成一组正交生物催化剂，用于具有单一立构中心的环化产物的对映异构合成。此外，使用CvRAP₅，四取代烯烃1q可以转化为具有季碳的高度对映体富集的产物2q（图5b）。MD模拟进一步证实了实验结果。
图 5. 演进的 CvRAP₁ –CvRAP₆的效用
图 6. 酶活性位点内自由基环化的 MD 模拟
【总结】
本文将天然的FAPs作为非天然的RAPs进行了再利用和进化，通过开壳机制催化立体控制环化。高通量实验平台的进步使得FAPs的定向进化得以实现，从而开发出一系列具有高度化学和立体选择性的RAPs。值得注意的是，一组非对映和对映体分歧的RAP变体被成功进化出来，从而可以制备出立体化学二元化合物的所有四种可能的立体异构体。这些成果代表了将天然光酶重新用于实现新自然化学的努力，凸显了天然光酶在解决悬而未决的合成问题方面未得到充分重视的作用。在新自然光酶催化领域，与之前研究的通过激发态黄氢醌的强还原性进行操作的"烯"还原酶的黄酮酶学不同，从天然FAPs重新利用的RAPs利用激发态黄氢醌的强氧化力启动自由基生物转化。总之，FAPs的杂合性和特殊进化性突显了它们在应对自由基化学和不对称催化领域长期挑战方面的巨大潜力。
